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一、基礎(chǔ)試劑與耗材

1. 膠原酶粉末（根據(jù)組織選型：

· 軟組織 / 脂肪：Ⅰ 型

· 骨骼、軟骨：Ⅱ 型

· 胰島、腫瘤、上皮：Ⅳ 型）

1. 基礎(chǔ)溶劑：無(wú)鈣鎂 PBS / DMEM/F12 / HBSS（無(wú)菌，預(yù)冷）

2. 輔助添加劑（按需）：BSA、HEPES、DNase I、青霉素 - 鏈霉素

3. 無(wú)菌濾器：0.22μm 水系濾膜

二、常用工作濃度（臨床 / 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）

1. 儲(chǔ)存液（10× 母液，1000 U/mL）

配方：1000 U 膠原酶粉末 + 1 mL 無(wú)菌 HBSS / 無(wú)鈣 PBS 例：配 10 mL 母液 膠原酶粉末：10000 U 溶劑：10 mL 無(wú)鈣鎂 HBSS 操作：

1. 冰上避光溶解，輕柔吹打，禁止劇烈震蕩（酶易失活）

2. 0.22μm 濾器過(guò)濾除菌

3. 分裝 1 mL / 管，-20℃避光凍存，避免反復(fù)凍融

2. 常規(guī)工作液（1×，100 U/mL）

取 1 份 10× 儲(chǔ)存液 + 9 份基礎(chǔ)培養(yǎng)基 / HBSS 終濃度：100 U/mL，適用于脂肪、肝、皮下軟組織消化

3. 低濃度工作液（50 U/mL，嬌嫩組織：胰島、乳腺上皮）

1 份 10× 母液 + 19 份緩沖液

三、完整分步配制流程（無(wú)菌操作，全程冰浴）

1. 預(yù)冷緩沖液 無(wú)鈣鎂 HBSS 37℃預(yù)熱或 4℃冰浴，含鈣鎂會(huì)抑制膠原酶活性。

2. 稱量溶解 按目標(biāo)單位稱取膠原酶，緩慢加入緩沖液，冰上靜置 10–20 min 自然溶解，輕吹打混勻。

禁止渦旋高速震蕩，蛋白變性失活。

1. 添加保護(hù)劑（推薦） 每 10 mL 溶液加 10 mg BSA（0.1%），穩(wěn)定酶活性，減少細(xì)胞損傷； 如需減少細(xì)胞團(tuán)塊：加 DNase I 至終濃度 10–20 μg/mL。

2. 除菌過(guò)濾 用 0.22μm 一次性濾器負(fù)壓過(guò)濾，膠原酶不能高壓滅菌（高溫失活）。

3. 分裝保存 母液分裝凍存；工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃可存放 24 h，不建議長(zhǎng)期冷藏。

四、不同組織專用配方參考

1. 脂肪組織消化液（Ⅰ 型膠原酶）

HBSS + 100 U/mL Ⅰ 型膠原酶 + 1% BSA + 1% 雙抗 37℃水浴搖床消化 30–60 min

2. 軟骨 / 骨組織（Ⅱ 型膠原酶）

DMEM + 150 U/mL Ⅱ 型膠原酶 + 0.5% BSA，消化 2–4 h

3. 胰島分離（Ⅳ 型膠原酶）

HBSS + 50–80 U/mL Ⅳ 型膠原酶 + HEPES 10 mM，冰上灌注、37℃短時(shí)消化

五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 溫度：膠原酶 37℃活性最高，溶解、保存全程低溫；

2. 離子：無(wú)鈣鎂緩沖液配制，Ca2?、Mg2?降低酶活；

3. 滅活：消化結(jié)束后，加含血清培養(yǎng)基中和（血清蛋白結(jié)合膠原酶終止反應(yīng)）；

4. 失效：凍融＞3 次、室溫放置超過(guò) 2 h 酶活性大幅下降，建議現(xiàn)配工作液；

5. 避光：膠原酶粉末及溶液避光保存，光照加速失活。

六、簡(jiǎn)易快速配液示例（10 mL 100 U/mL 工作液）

1. 取 1 mL 1000 U/mL 膠原酶母液；

2. 加入 9 mL 無(wú)菌無(wú)鈣 HBSS；

3. 加入 100 mg BSA 充分溶解；

4. 0.22μm 過(guò)濾，即刻用于組織消化。