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ECL發(fā)光液（Enhanced Chemiluminescence，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光）是Western Blot實(shí)驗(yàn)中常用的蛋白檢測手段，其核心原理是在辣根過氧化物酶（HRP）催化下，魯米諾（Luminol）與（H?O?）發(fā)生氧化反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)中間體并釋放光子（波長約425 nm），從而產(chǎn)生可被X光膠片或成像系統(tǒng)捕獲的熒光信號(hào)。

以下是標(biāo)準(zhǔn)且高效的ECL發(fā)光液使用方法：

一、工作液配制

?現(xiàn)配現(xiàn)用?：大多數(shù)ECL發(fā)光液由A液（發(fā)光底物）和B液（增強(qiáng)劑/過氧化物）組成，需在使用前等體積混合（如1:1）。

?避光操作?：混合過程應(yīng)避光進(jìn)行，防止試劑提前降解。

?即用型產(chǎn)品?：部分新型超敏發(fā)光液為即用型，無需預(yù)混，可直接滴加，減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

二、膜處理與孵育

完成轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗與二抗孵育后，用PBST或TBST充分洗滌3次，每次5–10分鐘。

用平頭鑷取出膜，濾紙輕吸去多余液體（勿接觸蛋白面）。

將膜蛋白面朝上置于潔凈保鮮膜或塑料容器中。

三、發(fā)光反應(yīng)

根據(jù)膜面積滴加ECL工作液（推薦用量：?0.1–0.125 mL/cm2?），確保覆蓋。

室溫孵育1–3分鐘（超敏試劑可縮短至10–15秒），避免過長時(shí)間導(dǎo)致背景升高。

輕輕瀝干多余液體，勿水洗。

四、信號(hào)檢測

?壓片檢測?：

將膜夾于兩層保鮮膜之間，趕盡氣泡。

放入暗盒，蛋白面朝上，覆蓋X光膠片。

曝光時(shí)間從數(shù)秒至數(shù)小時(shí)不等，弱信號(hào)可延長至10小時(shí)。

?化學(xué)發(fā)光成像儀檢測?：

直接將膜放入成像儀，按設(shè)備說明采集圖像。

可實(shí)時(shí)調(diào)整曝光時(shí)間，避免過曝或信號(hào)不足。