ELISA試劑盒實驗中每一個步驟都尤為重要，細節(jié)不容忽視，它是實驗成功的關(guān)鍵與否；在這里方便各位了解，更好的完成實驗，對ELISA試劑盒的實驗原理和操作步驟做出以下分析，供大家參考：
實驗原理：
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗該指標抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗該指標抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
實驗前的準備工作：
1、準備好所有實驗額外所需物品，如試管 吸頭 移液器 離心機等；
2、確定試劑盒在有效期內(nèi)；
3、仔細閱讀說明書；
4、按說明書確定所有試劑齊全；
5、標本制備要規(guī)范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備，盡量分裝做備份；
6、根據(jù)檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量；
7、按說明書將所用試劑盒平衡至室溫，配制所需試劑。
ELISA試劑盒的操作步驟：
1、使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差；
2、根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)；
3、加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時；
4、甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次；
5、每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘；
6、甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次；
7、每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照；
8、取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果；
9、在450nm波長處測定各孔的OD值。
